Caratteristica principale del club erano le provocazioni al costume e la stravaganza delle serate proposte. L’intento di Rubell e Schrager era infatti quello di garantire ogni sera “la festa più grande del mondo”, nonché quello di scioccare Manhattan con i propri eccessi edonistici: nel locale si trovavano sempre musica ad altissimo volume, scenografie allusive (emblematica era l’immagine di una falce di luna imboccata da un cucchiaino contenente polvere scintillante) e serate che ogni sabato prevedevano una nuova sorpresa o stravaganze inedite. Al culmine di ogni serata appariva dall’alto l'”uomo sulla luna”, che calava tra il pubblico e offriva ai presenti il luccicante contenuto di un cucchiaino d’argento.
Lo Studio 54 si distinse fin da subito come un luogo in cui ciascuno poteva essere protagonista a prescindere dal ceto di appartenenza, trovandosi fianco a fianco con esponenti del jet set internazionale. Il pubblico sentiva parlare di scene orgiastiche e di favolosi megaparties a tema. Lo Studio 54 fu anche la prima discoteca ad adottare una selezione sistematica all’ingresso delle persone a cui consentire l’accesso, nota per essere estremamente rigida e soggettiva (in base all’aspetto estetico e al gusto nel vestire); sovente era proprio Steve Rubell a selezionare i pochissimi fortunati a poter entrare tra la folla. Per promuovere l’inclusione sociale, la discoteca adottava inoltre una politica d’ingresso che mirava a far sì che almeno il 20% dei clienti fosse gay, e almeno il 10% lesbica o trans. Per questi stessi motivi, l’artista Andy Warhol, habitué dello Studio 54, imputò lo strepitoso successo del locale al suo essere “una dittatura all’ingresso e una democrazia sulla pista da ballo”.
Gli eventi che avvenivano all’interno erano immancabilmente raccontati dai giornali di tutto il mondo. Molti personaggi famosi hanno visto comparire le loro foto sui notiziari unicamente per aver passato una notte al 54. Fece epoca, per esempio, la foto di Bianca Jagger che il 2 maggio 1977, per festeggiare il suo compleanno, entrò in pista cavalcando un cavallo bianco; il videoclip del singolo New York City Boy dei Pet Shop Boys venne girato in parte nel locale e in un frammento del video si vede la scena del cavallo bianco che entra.
Numerosissime furono le celebrità del periodo a frequentare lo Studio 54. Tra queste spiccano i nomi degli attori Woody Allen, John Belushi, Sean Connery, Robert De Niro, Michael Douglas, Faye Dunaway, Richard Gere, Margaux Hemingway, Dustin Hoffman, Bette Midler, Liza Minnelli, Olivia Newton-John, Jack Nicholson, Al Pacino, Arnold Schwarzenegger, Sylvester Stallone, Elizabeth Taylor, John Travolta, Robin Williams; dei musicisti Bee Gees, Leonard Bernstein, David Bowie, James Brown, Cher, Alice Cooper, Marvin Gaye, Debbie Harry, Michael Jackson, Mick Jagger, Rick James, Elton John, Grace Jones, Tom Jones, Amanda Lear, John Lennon, Freddie Mercury, George Michael, Giorgio Moroder, Dolly Parton, Lou Reed, Keith Richards, Frank Sinatra, Rod Stewart, Barbra Streisand, Stevie Wonder; degli artisti Michail Baryšnikov, Truman Capote, Salvador Dalí, Elio Fiorucci, Tom Ford, Diane von Fürstenberg, Martha Graham, Halston, Tommy Hilfiger, Calvin Klein, Karl Lagerfeld, Rudolf Nureyev, Paloma Picasso, Francesco Scavullo, Valentino, Andy Warhol; delle modelle Gia Carangi e Farrah Fawcett, nonché delle ex first ladies Betty Ford e Jackie Kennedy. Anche una sconosciuta Madonna, ai tempi ancora una cantante emergente ma nello stesso tempo una grande frequentatrice di discoteche, era solita frequentare il locale. Si ricorda anche la presenza di Pelè, della cantante rock italiana Loredana Bertè nonché degli attori Marcello Mastroianni e Gérard Depardieu.
Altrettanto numerosi furono gli artisti che vi si esibirono, tra cui: Grace Jones, Chic, i noti DJ Louis Gison e Alì Bousfiha, il cantante Sket, Diana Ross ed Amii Stewart. Alla serata inaugurale, nel 1977, partecipò anche il futuro presidente degli Stati Uniti Donald Trump, all’epoca ancora non entrato in politica, con l’allora moglie Ivana.